真菌感染的實驗室診斷-1真菌的標本采集

真菌的標本采集

衛(wèi)生部北京醫(yī)院 艾效曼

一、采集真菌標本的目的

（一）常見真菌病的分類

常見真菌病分為淺部真菌病和深部真菌病。淺部真菌病分為淺表真菌病和皮膚真菌??；深部真菌病分為皮下真菌病和系統(tǒng)性真菌病。

了解真菌病的分類有利于在采集標本時對不同菌種進行目的性的采樣以及培養(yǎng)。

（二）主要真菌病病原及好發(fā)部分

淺部真菌病的好發(fā)部位主要是腳趾間、皮膚、生殖器區(qū)域，頭皮和面部，主要病原菌包括表皮癬菌屬，毛癬菌屬等。皮下真菌的好發(fā)部位主要是手、臂、足、腿，主要病原菌有申克孢子絲菌、疣狀瓶霉及其他真菌。系統(tǒng)性真菌病的主要好發(fā)部位以肺、皮膚、口腔、腸道及陰道為主，主要病原菌包括曲霉菌屬、酵母菌屬及新型隱球菌等。在取樣時，根據(jù)其好發(fā)部位及其異感病原體選擇適當?shù)牟杉团囵B(yǎng)方法。

二、真菌標本的采集

（一）呼吸道標本的采集

1 、呼吸道標本

（ 1 ）下呼吸道標本：痰液、毛刷、支氣管肺泡灌洗液等；

（ 2 ）上呼吸道標本：鼻咽部標本。

在領取呼吸道標本時同樣遵循的是應當在使用抗菌藥物前最好在清晨采集痰標本，不要用非無菌的水漱口。若領取下呼吸道來源的痰標本時，則不應當領取唾液或者鼻咽后壁的分泌物，應將標本收集在羅口無菌容器內(nèi)立即送檢，以防止其他的細菌過度生長。

2 、呼吸道常見真菌

呼吸道常見真菌有念珠菌屬、曲霉菌，免疫力低下患者可見卡氏肺孢子菌、莢膜組織胞漿菌、隱球菌。

3 、呼吸道標本的真菌涂片檢測

（ 1 ）直接涂片檢測濕片檢測曲霉菌；

（ 2 ）革蘭染色檢測酵母樣真菌孢子及假菌絲；

（ 3 ）六甲亞基四胺銀染色檢測卡氏肺孢子菌；

（ 4 ）墨汁染色檢測隱球菌。

4 、呼吸道標本的真菌培養(yǎng)基

呼吸道標本的真菌培養(yǎng)基為克瑪嘉真菌顯色培養(yǎng)基；懷疑其他絲狀真菌時加種其他培養(yǎng)基。

（二）尿液標本的采集

1 、尿液標本

無菌中段尿 10-20ml 。

清潔中段尿標本最為常用。最好由醫(yī)護人員采集或者在醫(yī)護人員的指導下由患者留取，避免樣本污染。此外還可以采取導尿法、穿刺法等，均為無菌留取。

2 、尿液標本常見真菌

尿液標本中常見的真菌多為念珠菌屬。

3 、尿液標本真菌涂片

尿液標本真菌涂片通采用 3000 轉(zhuǎn) / 分，離心 10 分鐘，涂片進行革蘭染色查念珠菌屬及假菌絲。

4 、尿液標本真菌培養(yǎng)基

尿液標本真菌培養(yǎng)基最常用的是克瑪嘉真菌顯色培養(yǎng)基，進行定量接種。

（三）泌尿生殖道標本的采集

1 、生殖道標本

采集生殖道標本進行微生物學檢查主要對象包括：出現(xiàn)宮頸炎、外陰陰道炎、尿道炎、盆腔感染、子宮內(nèi)膜炎或生殖道潰瘍的女性，或患有尿道炎、附睪炎、前列腺炎或生殖道潰瘍的男性病人。

女性標本包括尿道分泌物、巴氏腺、尿道旁腺、陰道分泌物、宮頸分泌物、宮腔內(nèi)容物、羊水等。男性標本包括尿道分泌物、前列腺按摩液、精液、附睪和睪丸。留取時用無菌拭子采集，特別是出現(xiàn)紅、腫、痛時進行采集陽性分辨率較高。采集時先用生理鹽水清潔創(chuàng)面，用無菌拭子粘取其邊緣或基底部的分泌物進行送檢。

2 、生殖道標本常見真菌

生殖道標本中常見的真菌為念珠菌屬。在留取泌尿道生殖道標本時盡量用無菌拭字采集粘膜上的標本進行涂片，可以看到白色假絲酵母菌。

3 、生殖道標本真菌涂片

生殖道標本建議直接進行真菌涂片，行革蘭染色查念珠菌屬及假菌絲。

4 、生殖道標本真菌培養(yǎng)基

生殖道標本真菌培養(yǎng)基以克瑪嘉真菌顯色培養(yǎng)基為主，可以加入沙堡弱培養(yǎng)基。

（四）血液及無菌體液骨髓標本

1 、血液及無菌體液標本

菌血液的癥狀可分為時性間歇性和持續(xù)性，不清楚菌血癥類型時可依照下述標準進行血液培養(yǎng)：（ 1 ）發(fā)熱體溫大于 38 攝氏度；（ 2 ）體溫多低，低于 36 攝氏度；（ 3 ）白細胞數(shù)目增高大于 10 × 10⁹/L ；（ 4 ）中性細胞過少，小于 1 × 10⁹/L ；上述四項中患者出現(xiàn)一項或者以上均應做血液培養(yǎng)。

由于血液或無菌血液中發(fā)生真菌感染時，真菌為絕對血養(yǎng)菌，因此當懷疑真菌感染時一定要抽血兩瓶，抽血量為成人 5-8ml ，兒童每瓶抽 1-5ml 。抽血時宜選擇對間接性寒顫、發(fā)熱寒顫、體溫高峰前 0.5-1 小時取血，或于寒顫或發(fā)熱后 1h 進行標本采集，一般不建議在發(fā)熱高峰時抽血。血培養(yǎng)盡量選擇在抗菌藥物前進行，推薦雙側(cè)雙瓶抽血，使真菌只在血樣瓶中。

2 、血液及無菌體液標本常見真菌

血液中常見的真菌為念珠菌屬如白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌。近年來真菌血流的感染率逐年增加，一般發(fā)生于有基礎疾病或有廣譜抗菌素應用史患者， 50% 發(fā)生在 ICU ，尤其多見于靜脈管患者，白色假絲酵母菌占念珠菌屬癥的 70-83% ，死亡率很高，接近 50% ，因此對于支管病人特別是滯留血管病人應密切注意導管相關性血流感染。

3 、血液的培養(yǎng)

不同于細菌血流感染的血培養(yǎng)瓶良性報陽時間，血培養(yǎng)瓶真菌感染大多在 48 小時后，報陽性生長曲線較細菌生長曲線平緩，因此 48 小時后報陽的血培養(yǎng)瓶，應密切考慮真菌感染，同時加種真菌培養(yǎng)基。

（五）腦脊液標本的采集

1 、腦脊液標本

當病原體通過血腦屏障系統(tǒng)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，可引起感染，常見的真菌腦脊液感染為新型隱球菌，成人腦脊液送檢指標為發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、頸項強直反射增強等，兒童和新生兒的臨床癥狀不為明顯。

腦脊液標本的采集通常采取腰穿的方式，用消毒液和酒精消毒藥腰穿的部位，以避免標本污染和對患者造成感染， 將取出的腦脊液順序打入無菌管并標號，每管標本兩毫升左右，如果做深化常規(guī)細菌學和細菌學技術(shù)則可以抽三管，應將渾濁管和第二管、或第二管送細菌學檢測，特殊情況下可采用小腦延髓池或腦室穿刺術(shù) , 進行腦脊液標本的留取。

初始腦脊液收集應在抗生素應用之前，這樣可以顯著提高致病菌的檢出率?？股貞靡院竺績傻饺焖蜋z一次腦脊液標本以及監(jiān)測治療效果。當懷疑腦脊液中有真菌感染時送腦脊液培養(yǎng)的同時應送檢血培養(yǎng)。

2 、腦脊液標本常見真菌及涂片檢測

腦脊液標本中最常見的真菌為新型隱球菌，因此在留取腦脊液標本后應當常規(guī)檢查新型隱球菌用墨汁染色檢查。

3 、腦脊液培養(yǎng)

腦脊液真菌培養(yǎng)時應選擇沙堡弱培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基，因為新型隱球菌的生長速度較其他念珠菌屬速度慢，因此在培養(yǎng)時應當延長培養(yǎng)時間，最長可延至兩周。用于治療的抗真菌藥物濃度較高，在檢查腦脊液新型隱球菌時涂片的陽性率應要比培養(yǎng)的陽性率要高，因此在送檢腦脊液檢查真菌時務必送檢墨汁染色，查新型隱球菌，不可以單獨送培養(yǎng)。

隱球菌腦膜炎是隱球菌通過呼吸隨塵埃一起進入呼吸道內(nèi)，在由肺部經(jīng)血液進入神經(jīng)系統(tǒng)而感染。由于腦脊液中缺乏正常血清中所含有的補體和抗隱球菌生長因子，因此隱球菌性腦膜炎的發(fā)病率較高，其愈后也很差。目前國際上的死亡率高達 20%-30% 。該菌常有導致免疫力低下患者的源發(fā)病，因此當患者免疫力低下出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、嘔吐或伴有神志改變、腦膜刺激癥明顯、頸項強直陽性、個別視力模糊伴視盤水腫時高度懷疑隱球菌感染。送檢腦脊液時應當送檢墨汁染色查新型隱球菌。

（六）各類拭子及膿液標本的采集

1 、拭子及膿液標本

拭子及膿液標本：傷口拭子、膿腫、組織活檢標本、中耳拭子、眼拭子，在采集時要求嚴格無菌操作。

2 、傷口拭子常見真菌

傷口拭子常見真菌：念珠菌屬如白色假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、曲霉菌等。

3 、傷口拭子標本的真菌涂片檢測

傷口拭子標本的真菌涂片檢測：革蘭染色檢測酵母樣真菌孢子及假菌絲。

由于傷口標本和各類拭子標本位于體表，因此在標本采集后，除培養(yǎng)目的外都應直接加做涂片檢查。

4 、傷口拭子標本的真菌培養(yǎng)基

在接種培養(yǎng)基時應當接種沙保弱培養(yǎng)基，多為克瑪嘉真菌顯色培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)最終的陰性報告通常為 28 天，以排除淺部真菌感染、絲狀真菌感染，如已長出酵母樣真菌或只懷疑酵母樣真菌感染則需連續(xù)培養(yǎng) 5 日才能發(fā)陰性報告。

（七）頭發(fā)、皮屑、皮癬及指甲等標本的采集

1 、頭發(fā)、皮屑、皮癬及指甲等標本

用 75% 酒精消毒 , 盡量暴露感染部位，用無菌器具進行皮屑的采集和送檢。

皮屑：皮損的邊緣、皰壁、膿液、深層趾（指）間皮屑或活動邊緣皮屑；

甲屑：用細銼或牙科磨鉆取病甲與正常甲交界處并且貼近甲床部的甲屑；

毛發(fā)：取病發(fā) 15 根、 75% 酒精消毒， 3 ～ 5 根作直接鏡檢， 5 ～ 10 根種于 SDA 斜面（加氯霉素），稍劃破斜面掩埋。

2 、頭發(fā)、皮屑、皮癬及指甲等標本常見真菌：

黃癬：許蘭黃癬病、罕見須癬毛癬菌、疣狀癬菌、犬小孢子菌；

毛孢子菌?。喊咨咦泳?、何德毛結(jié)節(jié)菌；

體癬：毛癬菌屬、表皮癬菌屬、小孢子菌屬；

疊瓦癬：紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌；

甲真菌?。杭t色毛癬菌、須癬毛癬菌、罕見須癬毛癬菌等、白色念珠菌、白地霉、短帚霉、頭孢屬、支頂孢屬；

著色性真菌?。吼酄钇棵埂⒄缡贤馄棵沟?。

3 、頭發(fā)、皮屑、皮癬及指甲等標本的涂片檢測

潛部真菌的標本常用直接涂片鏡檢濕片或染色。

如果是濕片則在載玻片上先滴加百分之十的氫氧化鉀，然后用透明膠帶在感染部位粘取標本，將膠帶的標本面貼于試劑上，顯微鏡高倍鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)，如不清晰可在另一張載玻片上加上棉蘭試劑，用透明膠帶粘取標本，將膠帶的標本面貼于燃料試劑上，在顯微鏡高倍鏡視野下觀察菌絲孢子形態(tài)。

（八）便標本的采集

1 、便標本

自然排便或直腸拭子：粘液部分 5-10g, 或稀便 5-10g 。

2 、便標本的常見真菌

便標本的常見真菌有卵圓形芽生孢子或假菌絲，念珠菌相關性腹瀉必須菌量大于 105CFU/ml ，并且在糞便涂片中找到假菌絲。

3 、便標本的真菌培養(yǎng)基

便標本的真菌培養(yǎng)基常用克瑪嘉真菌顯色培養(yǎng)基。

三、常用培養(yǎng)真菌的基礎培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基

（一）常用基礎培養(yǎng)基：沙堡弱培養(yǎng)基 Sabouraud dextrose agar （ SDA ）、馬鈴薯培養(yǎng)基 potato dextrose agar （ PDA ）、麥芽浸汁培養(yǎng)基 malt extract agar （ MEA ）、橄欖油培養(yǎng)基（ ODA ）、燕麥培養(yǎng)基 oatmeal agar （ OA ）、察氏培養(yǎng)基 Czapek agar(CZA) 、放線菌酮培養(yǎng)基（ DTM ）。

（二）常用顯色培養(yǎng)基：科馬嘉顯色培養(yǎng)基（ CHROMagar ）。

（三）少量的血清進行培養(yǎng)可以進行血清出芽實驗。

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