真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷-4真菌的實(shí)驗(yàn)室鑒定方法

真菌的實(shí)驗(yàn)室鑒定方法

衛(wèi)生部北京醫(yī)院 艾效曼

一、真菌的分類(lèi)

真菌感染已成為繼細(xì)菌和病毒感染在內(nèi)的呼吸道感染之后的又一大感染源。

（一）條件致病酵母菌的分類(lèi)

條件致病酵母菌分為念珠菌屬和非念珠菌屬。念珠菌屬中有白色假性酵母和非白色假性酵母，其中非白色假性酵母包括光滑假性酵母、熱帶假性酵母、近平滑以及克柔假性酵母菌。非念珠菌屬常見(jiàn)的為隱球菌。

（二）絲狀真菌孢子

絲狀真菌也是感染的一大主要病原體，通常利用絲狀真菌的孢子對(duì)絲狀真菌進(jìn)行診斷。絲狀真菌的孢子按發(fā)生方式可以分為有性孢子和無(wú)性孢子。形態(tài)學(xué)中將分生孢子分為芽生孢子、葉狀孢子、孢子囊孢子以及有性孢子，通常利用孢子的形態(tài)進(jìn)行鑒定。

（三）臨床常見(jiàn)真菌病

按感染層面可以把真菌病劃分為淺部真菌病和深部真菌病。淺部真菌病包括：淺表真菌病和皮膚真菌病。常見(jiàn)的淺表真菌病有花斑癬、毛結(jié)節(jié)菌??；常見(jiàn)的皮膚真菌病有皮膚癬菌病、皮膚念珠菌病。深部真菌病包括：皮下真菌病及比較嚴(yán)重的系統(tǒng)性真菌病。常見(jiàn)的皮下真菌病有孢子絲菌病、著色芽生菌病、暗色絲孢霉病以及足菌腫；常見(jiàn)的系統(tǒng)性真菌病有念珠菌病、曲霉病、隱球菌病、接合菌病、雙向真菌感染。

根據(jù)好發(fā)部位可以推斷出大致的常見(jiàn)感染菌，再利用常見(jiàn)感染菌的形態(tài)特征或種菌特征，可以選擇更加適合的鑒定方法。如好發(fā)部位是皮表，可以利用直接涂片法或檢驗(yàn)消化法對(duì)其進(jìn)行直接鑒定；對(duì)于深部真菌的肺組織或腦膜炎流取的腦膜液，可以采用培養(yǎng)法或者是直接涂片法共同進(jìn)行鑒定；對(duì)于口腔、腸道及粘膜組織，可以利用檢測(cè)培養(yǎng)器的優(yōu)勢(shì)對(duì)其進(jìn)行酵母菌的鑒定。

二、真菌的培養(yǎng)方法

培養(yǎng)方法是真菌鑒定的主要方法之一。

（一）常用培養(yǎng)真菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基

常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：沙堡弱培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、麥芽浸汁培養(yǎng)基、橄欖油培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基等。常用的顯色培養(yǎng)基為科馬嘉顯色培養(yǎng)基?？梢岳醚鍖?duì)假絲酵母菌進(jìn)行出芽實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)，鑒定是否為白色假絲酵母菌?；A(chǔ)培養(yǎng)基、沙堡弱培養(yǎng)基可以制作成為液體，可以根據(jù)不同的培養(yǎng)時(shí)間或培養(yǎng)條件選擇斜面培養(yǎng)基或平板培養(yǎng)基。馬鈴薯培養(yǎng)基主要用于鑒別絲狀真菌，橄欖油培養(yǎng)基主要鑒別馬拉色菌，察氏培養(yǎng)基主要用于曲霉菌菌屬內(nèi)的鑒定。

選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對(duì)真菌培養(yǎng)致關(guān)重要。致病性真菌包括酵母樣真菌和絲狀真菌，但許多致病性真菌是雙相真菌，如莢膜組織胞漿菌在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的是絲狀真菌相，但在宿主細(xì)胞內(nèi)直接檢出時(shí)為酵母樣。因此，在懷疑真菌感染時(shí)一定要結(jié)合涂片以及培養(yǎng)共同進(jìn)行鑒定。在接種時(shí)，初代接種通常是劃線接種或在斜面的沙堡弱培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，增長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。對(duì)于第二代培養(yǎng)分離菌種時(shí)可以用固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)，也可以利用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察真菌菌絲后壁孢子以及絲狀真菌的其他形態(tài)。

（二）培養(yǎng)條件

在培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)格外注意培養(yǎng)的溫度、濕度、光照、通氣，適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，待孢子形成成熟后進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)基的理化性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分直接影響孢子的形成，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)成分少時(shí)更有利于孢子的形成，而絲狀真菌的主要鑒定就是孢子形態(tài)，因此利用寡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基可以更有效的培養(yǎng)出孢子。如果孢子形成還不夠成熟，可以利用劃破菌落刺激性刺激真菌的方式來(lái)促進(jìn)孢子的形成。

三、真菌的鑒定方法

真菌的鑒定主要分為鏡檢、培養(yǎng)顯色以及生化反應(yīng)、質(zhì)譜和其他非培養(yǎng)鑒定方法。

（一）鏡檢

直接涂片鏡檢是診斷真菌病的最主要的方法之一。

1 、鹽水直接涂片鏡檢

鹽水直接涂片鏡檢可以檢到的致病性真菌主要是酵母菌、孢子及絲狀真菌的菌絲。

2 、濕片直接鏡檢

在鹽水直接涂片不夠清晰時(shí)，可以利用濕片直接鏡檢。利用 10% 到 20% 的氫氧化鉀對(duì)皮癬掛絲進(jìn)行堿性消化，可以觀察到觀察皮膚癬菌、花斑癬菌、暗色真菌、曲霉等絲狀真菌與念珠菌。

當(dāng)遇到較厚的角質(zhì)標(biāo)本時(shí)，如指甲標(biāo)本或毛發(fā)標(biāo)本，可以利用 10% 到 20% 的氫氧化鉀加 40% 的二展氫亞峰對(duì)標(biāo)本進(jìn)行軟化之后再進(jìn)行壓片，可以觀察到暗色真菌、念珠菌等。

3 、革蘭染色

革蘭染色同樣適合于酵母樣真菌的檢出，酵母樣真菌用革蘭染色之后顯示藍(lán)紫色的革蘭陽(yáng)性菌，同時(shí)假菌性的觀察也非常的清晰。

4 、乳酸酚棉蘭染色

乳酸酚棉蘭染色可以對(duì)皮癬、膿等絲或者是絲狀真菌培養(yǎng)物進(jìn)行染色鑒別，可快速診斷花斑癬、絲狀真菌培養(yǎng)物的形態(tài)。

5 、墨汁染色

墨汁染染色是觀察新型隱球菌厚壁莢膜最有效的方法，適合的標(biāo)本包括腦積液、氣泡狀積液及液化的痰。

6 、瑞士染色

瑞士染色適合于檢查莢膜組織胞漿菌以及馬爾尼菲青霉菌，如果高度懷疑這兩種真菌感染時(shí)，一定要對(duì)組織進(jìn)行一次直接涂片，因?yàn)榍v膜組織胞漿菌在培養(yǎng)后成絲狀真菌象，不利于觀察。

7 、六胺銀染色

利用六胺銀染色，可以對(duì)肺部卡氏肺孢子蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)。

（二）顯色培養(yǎng)基

通常情況下，在對(duì)組織標(biāo)本或表皮標(biāo)本進(jìn)行涂片檢測(cè)后應(yīng)需培養(yǎng)鑒定，其中顯色培養(yǎng)基可以快速鑒定。

1 、顯色培養(yǎng)基的原理

顯色培養(yǎng)基的原理是：真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中自身代謝產(chǎn)生的酶，該酶與培養(yǎng)基中人工添加的顯色底物進(jìn)行反應(yīng)，呈現(xiàn)出不同的顏色，在 48 小時(shí)之后可以進(jìn)行快速鑒定。白色假絲酵母菌在克馬嘉型的培養(yǎng)菌上呈現(xiàn)出綠色、翠綠色；熱帶假絲酵母菌呈現(xiàn)藍(lán)灰色、鐵藍(lán)色，產(chǎn)生的色素可以擴(kuò)散到培養(yǎng)基中；克柔假絲酵母菌呈現(xiàn)粉紅色，粗糙有微毛，沿線生長(zhǎng)的現(xiàn)象較明顯；光滑假絲酵母菌呈現(xiàn)紫紅色，表面非光滑，反光；其他酵母菌呈現(xiàn)白色或其他顏色，拍成照片增加鑒定的經(jīng)驗(yàn)。

2 、顯色培養(yǎng)基的典型菌落形態(tài)

典型的白色假絲酵母菌呈現(xiàn)的綠色；熱帶假絲酵母菌呈現(xiàn)的藍(lán)紫色，同時(shí)菌密的色素能夠擴(kuò)散到培養(yǎng)基中；光滑球擬酵母菌和近平滑假絲酵母菌均為粉紅色，但光滑球擬酵母菌菌落非常光滑，有折光性，而近平滑假絲酵母菌則很有質(zhì)感，成毛鍋樣；葡萄牙假絲酵母菌有藍(lán)紫色的肉和色；漢遜假絲酵母菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，除了藍(lán)紫色較柔和外也有凸起的乳頭狀；頭地霉的主要形態(tài)非常的圓，邊緣呈現(xiàn)毛刺狀，經(jīng)過(guò)多天培養(yǎng)后，整個(gè)菌落在培養(yǎng)基表面上凸起；克柔假絲酵母菌邊緣為白色、中心為粉紅色，菌落兩端沿線生長(zhǎng)，易和頭地霉相混；釀酒假絲酵母呈紅紫色，乳頭狀明顯；粘紅假絲酵母的典型顏色為磚紅色；折皺假絲酵母及季也蒙假絲酵母不常見(jiàn)。

（三）生化鑒定

利用顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母真菌可以進(jìn)一步利用儀器法或試條法進(jìn)行鑒定。

法國(guó)生物 VPI 系統(tǒng)進(jìn)行的酵母染真菌的儀器、試條法鑒定，是利用酵母陽(yáng)真菌對(duì)糖的利用試驗(yàn)。儀器法有許多的孔，每個(gè)孔都是銅化實(shí)驗(yàn)，而 EPR20C 試條則是用 19 個(gè)銅化測(cè)定的干存體物小杯組成，共 20 個(gè)小杯，其中有生長(zhǎng)對(duì)照杯，小杯內(nèi)含有半固體微量培養(yǎng)基供接種用，只有酵母染真菌才能生長(zhǎng)。測(cè)定結(jié)果是以生長(zhǎng)對(duì)照物的濁度比較，如果等于或大于生長(zhǎng)孔的濁度則判定為陽(yáng)性，鑒定結(jié)果是參照分析圖索引軟件其中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定，方法較客觀， 20 ℃可鑒定多達(dá) 43 種酵母樣真菌。

（四）分子生物學(xué)檢測(cè)

質(zhì)譜檢測(cè)微生物的原理主要是通過(guò)激光、照射經(jīng)基質(zhì)消化的樣品，使樣品中的蛋白質(zhì)游離出來(lái)，在環(huán)形電極的典廠中進(jìn)行加速運(yùn)動(dòng)，不同質(zhì)量的蛋白質(zhì)推行的距離不同，從而形成了獨(dú)有的蛋白質(zhì)圖譜，根據(jù)蛋白質(zhì)圖譜的形狀和分布進(jìn)行菌種的鑒定。目前 VDI 的質(zhì)譜系統(tǒng)可以鑒定多達(dá) 50 種的真菌。

對(duì)于絲狀真菌的質(zhì)譜鑒定，應(yīng)當(dāng)采用純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。第一步是取適量的菌落，加入酒精進(jìn)行萃取，靜置后棄去上清，對(duì)沉淀物加 70% 的酒精，再加入 40ul 的引精，離心后取沉淀，此時(shí)為已經(jīng)萃取好的菌種，可以涂板加甲酸進(jìn)行鑒定。對(duì)于酵母樣真菌，可以直接將酵母樣真菌涂于靶板上，在未干燥之前加入 1ul 的甲酸后進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)的快速。

在分子生物學(xué)檢測(cè)中還有利用擴(kuò)增反應(yīng)的一些鑒定方法，如 RAPD 隨機(jī)顏物 PCR ，選擇 18SrDNA 和 28SrDNA 相對(duì)保守的區(qū)域，設(shè)計(jì)真菌的引物，可以進(jìn)行鑒定。

DNA 測(cè)試仍然是真菌鑒定最精標(biāo)準(zhǔn)，可以用于對(duì)于其他方法的比對(duì)實(shí)驗(yàn)。分型方法也可以用于真菌的鑒定。

（五）血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷的 G 試驗(yàn)和 GM 試驗(yàn)對(duì)真菌感染進(jìn)行輔助性診斷。

（ 1 ） G 實(shí)驗(yàn)

G 實(shí)驗(yàn)是測(cè)定 1-3- β -D- 葡聚糖含量。葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中， 1-3- β -D- 葡聚糖占據(jù)真菌細(xì)胞壁的 50% 以上，是真菌細(xì)胞壁的特有成分，而 1-3- β -D- 葡聚糖可以激活 G 因子，激活的 G 因子再可以去激活凝固酶原，使其轉(zhuǎn)化成為活性的凝固酶，該酶切斷凝固蛋白原中特定位置的精氨肽鏈，使蛋白發(fā)生凝結(jié)，以此來(lái)測(cè)定反映出真菌細(xì)胞壁中 1-3- β -D- 葡聚糖的含量。

導(dǎo)致 G 實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性的因素可能有：污染；應(yīng)用纖維素膜進(jìn)行血液透析患者；某些紗布或其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖；某些品牌的靜脈制劑（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；某些細(xì)菌敗血病患者（尤其是鏈球菌敗血癥）；抗腫瘤類(lèi)藥物（香菇多糖、裂殖菌多糖）；磺胺類(lèi)藥物；蘑菇類(lèi)食物等。一切含有葡聚糖的物品都會(huì)影響到 G 實(shí)驗(yàn)其形成假陽(yáng)性，因此在得到陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，應(yīng)當(dāng)追蹤詢(xún)問(wèn)一下臨床醫(yī)生是否有影響因素。

G 試驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)陰性值小于 60pg/ml 時(shí)可以排除侵襲性真菌感染，當(dāng)大于 100pg/ml 時(shí)則有異意。但因如果宿主不具備宿主感染因素以及侵襲性真菌感染的其他臨床癥狀，也不能輕易診斷，應(yīng)當(dāng)詢(xún)問(wèn)臨床核實(shí)有無(wú)假陽(yáng)性的影響因素在內(nèi)?；疑珔^(qū)間應(yīng)結(jié)合臨床動(dòng)態(tài)觀察。危急值尚不明確，建議將 G 試驗(yàn)兩次陽(yáng)性結(jié)果作為危急值報(bào)告。

（ 2 ） GM 試驗(yàn)

GM 試驗(yàn)是用于輔助診斷曲霉菌感染的一個(gè)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。

半乳甘露聚糖，簡(jiǎn)寫(xiě)為 GM ，是曲霉菌細(xì)胞壁上一種獨(dú)特的多聚抗原， GM 試驗(yàn)就是檢測(cè)這一類(lèi)多聚抗原的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)原理是直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢，敏感性可以達(dá)到 83% ，特異性可以達(dá)到 90% ，同時(shí) GM 陰性可以排除曲霉病，應(yīng)用價(jià)值要高于陽(yáng)性應(yīng)用價(jià)值。

當(dāng) GM 實(shí)驗(yàn)結(jié)果大于 0.95 μ g/L 時(shí)，判為陽(yáng)性，懷疑有曲霉菌感染。當(dāng)小于 0.75 μ g/L 時(shí)，則可以排除曲霉菌感染。灰區(qū)范圍建議建議連續(xù)多次檢測(cè)并應(yīng)結(jié)合臨床資料綜合評(píng)價(jià)。

聲明：以上內(nèi)容來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，若有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們，立即刪除！所有的觀點(diǎn)由網(wǎng)友個(gè)人想法，不代表本公司也持此立場(chǎng)，感謝大家支持！

重慶英沐教育科技有限公司

YMU教育

重慶YMU教育_醫(yī)學(xué)繼續(xù)教育學(xué)分卡

重慶YMU教育_小學(xué)初中高中教育課后輔導(dǎo)

重慶YMU教育_執(zhí)業(yè)醫(yī)師護(hù)士藥師資格考試考前輔導(dǎo)

www.kawsbarofficials.com

www.ymujiaoyu.com

YMU教育(www.kawsbarofficials.com)，全國(guó)熱線電話：023-89119533；提供繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)分、中小學(xué)課后輔導(dǎo)、美年大健康·慈銘體檢大牌定制健康體檢等服務(wù)；