熱線：023-89119533

91ymu.com

真菌感染的實驗室診斷-4真菌的實驗室鑒定方法

真菌的實驗室鑒定方法

衛(wèi)生部北京醫(yī)院艾效曼

一、真菌的分類

真菌感染已成為繼細菌和病毒感染在內(nèi)的呼吸道感染之后的又一大感染源。

（一）條件致病酵母菌的分類

條件致病酵母菌分為念珠菌屬和非念珠菌屬。念珠菌屬中有白色假性酵母和非白色假性酵母，其中非白色假性酵母包括光滑假性酵母、熱帶假性酵母、近平滑以及克柔假性酵母菌。非念珠菌屬常見的為隱球菌。

（二）絲狀真菌孢子

絲狀真菌也是感染的一大主要病原體，通常利用絲狀真菌的孢子對絲狀真菌進行診斷。絲狀真菌的孢子按發(fā)生方式可以分為有性孢子和無性孢子。形態(tài)學(xué)中將分生孢子分為芽生孢子、葉狀孢子、孢子囊孢子以及有性孢子，通常利用孢子的形態(tài)進行鑒定。

（三）臨床常見真菌病

按感染層面可以把真菌病劃分為淺部真菌病和深部真菌病。淺部真菌病包括：淺表真菌病和皮膚真菌病。常見的淺表真菌病有花斑癬、毛結(jié)節(jié)菌??；常見的皮膚真菌病有皮膚癬菌病、皮膚念珠菌病。深部真菌病包括：皮下真菌病及比較嚴重的系統(tǒng)性真菌病。常見的皮下真菌病有孢子絲菌病、著色芽生菌病、暗色絲孢霉病以及足菌腫；常見的系統(tǒng)性真菌病有念珠菌病、曲霉病、隱球菌病、接合菌病、雙向真菌感染。

根據(jù)好發(fā)部位可以推斷出大致的常見感染菌，再利用常見感染菌的形態(tài)特征或種菌特征，可以選擇更加適合的鑒定方法。如好發(fā)部位是皮表，可以利用直接涂片法或檢驗消化法對其進行直接鑒定；對于深部真菌的肺組織或腦膜炎流取的腦膜液，可以采用培養(yǎng)法或者是直接涂片法共同進行鑒定；對于口腔、腸道及粘膜組織，可以利用檢測培養(yǎng)器的優(yōu)勢對其進行酵母菌的鑒定。

二、真菌的培養(yǎng)方法

培養(yǎng)方法是真菌鑒定的主要方法之一。

（一）常用培養(yǎng)真菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基

常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：沙堡弱培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、麥芽浸汁培養(yǎng)基、橄欖油培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基等。常用的顯色培養(yǎng)基為科馬嘉顯色培養(yǎng)基。可以利用血清對假絲酵母菌進行出芽實驗的培養(yǎng)，鑒定是否為白色假絲酵母菌。基礎(chǔ)培養(yǎng)基、沙堡弱培養(yǎng)基可以制作成為液體，可以根據(jù)不同的培養(yǎng)時間或培養(yǎng)條件選擇斜面培養(yǎng)基或平板培養(yǎng)基。馬鈴薯培養(yǎng)基主要用于鑒別絲狀真菌，橄欖油培養(yǎng)基主要鑒別馬拉色菌，察氏培養(yǎng)基主要用于曲霉菌菌屬內(nèi)的鑒定。

選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對真菌培養(yǎng)致關(guān)重要。致病性真菌包括酵母樣真菌和絲狀真菌，但許多致病性真菌是雙相真菌，如莢膜組織胞漿菌在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的是絲狀真菌相，但在宿主細胞內(nèi)直接檢出時為酵母樣。因此，在懷疑真菌感染時一定要結(jié)合涂片以及培養(yǎng)共同進行鑒定。在接種時，初代接種通常是劃線接種或在斜面的沙堡弱培養(yǎng)基上進行接種，增長培養(yǎng)時間。對于第二代培養(yǎng)分離菌種時可以用固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)，也可以利用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察真菌菌絲后壁孢子以及絲狀真菌的其他形態(tài)。

（二）培養(yǎng)條件

在培養(yǎng)時，應(yīng)格外注意培養(yǎng)的溫度、濕度、光照、通氣，適當(dāng)延長培養(yǎng)時間，待孢子形成成熟后進行鑒定。培養(yǎng)基的理化性質(zhì)及營養(yǎng)成分直接影響孢子的形成，當(dāng)營養(yǎng)成分少時更有利于孢子的形成，而絲狀真菌的主要鑒定就是孢子形態(tài)，因此利用寡營養(yǎng)的培養(yǎng)基可以更有效的培養(yǎng)出孢子。如果孢子形成還不夠成熟，可以利用劃破菌落刺激性刺激真菌的方式來促進孢子的形成。

三、真菌的鑒定方法

真菌的鑒定主要分為鏡檢、培養(yǎng)顯色以及生化反應(yīng)、質(zhì)譜和其他非培養(yǎng)鑒定方法。

（一）鏡檢

直接涂片鏡檢是診斷真菌病的最主要的方法之一。

1 、鹽水直接涂片鏡檢

鹽水直接涂片鏡檢可以檢到的致病性真菌主要是酵母菌、孢子及絲狀真菌的菌絲。

2 、濕片直接鏡檢

在鹽水直接涂片不夠清晰時，可以利用濕片直接鏡檢。利用 10% 到 20% 的氫氧化鉀對皮癬掛絲進行堿性消化，可以觀察到觀察皮膚癬菌、花斑癬菌、暗色真菌、曲霉等絲狀真菌與念珠菌。

當(dāng)遇到較厚的角質(zhì)標本時，如指甲標本或毛發(fā)標本，可以利用 10% 到 20% 的氫氧化鉀加 40% 的二展氫亞峰對標本進行軟化之后再進行壓片，可以觀察到暗色真菌、念珠菌等。

3 、革蘭染色

革蘭染色同樣適合于酵母樣真菌的檢出，酵母樣真菌用革蘭染色之后顯示藍紫色的革蘭陽性菌，同時假菌性的觀察也非常的清晰。

4 、乳酸酚棉蘭染色

乳酸酚棉蘭染色可以對皮癬、膿等絲或者是絲狀真菌培養(yǎng)物進行染色鑒別，可快速診斷花斑癬、絲狀真菌培養(yǎng)物的形態(tài)。

5 、墨汁染色

墨汁染染色是觀察新型隱球菌厚壁莢膜最有效的方法，適合的標本包括腦積液、氣泡狀積液及液化的痰。

6 、瑞士染色

瑞士染色適合于檢查莢膜組織胞漿菌以及馬爾尼菲青霉菌，如果高度懷疑這兩種真菌感染時，一定要對組織進行一次直接涂片，因為莢膜組織胞漿菌在培養(yǎng)后成絲狀真菌象，不利于觀察。

7 、六胺銀染色

利用六胺銀染色，可以對肺部卡氏肺孢子蟲進行檢測。

（二）顯色培養(yǎng)基

通常情況下，在對組織標本或表皮標本進行涂片檢測后應(yīng)需培養(yǎng)鑒定，其中顯色培養(yǎng)基可以快速鑒定。

1 、顯色培養(yǎng)基的原理

顯色培養(yǎng)基的原理是：真菌在生長過程中自身代謝產(chǎn)生的酶，該酶與培養(yǎng)基中人工添加的顯色底物進行反應(yīng)，呈現(xiàn)出不同的顏色，在 48 小時之后可以進行快速鑒定。白色假絲酵母菌在克馬嘉型的培養(yǎng)菌上呈現(xiàn)出綠色、翠綠色；熱帶假絲酵母菌呈現(xiàn)藍灰色、鐵藍色，產(chǎn)生的色素可以擴散到培養(yǎng)基中；克柔假絲酵母菌呈現(xiàn)粉紅色，粗糙有微毛，沿線生長的現(xiàn)象較明顯；光滑假絲酵母菌呈現(xiàn)紫紅色，表面非光滑，反光；其他酵母菌呈現(xiàn)白色或其他顏色，拍成照片增加鑒定的經(jīng)驗。

2 、顯色培養(yǎng)基的典型菌落形態(tài)

典型的白色假絲酵母菌呈現(xiàn)的綠色；熱帶假絲酵母菌呈現(xiàn)的藍紫色，同時菌密的色素能夠擴散到培養(yǎng)基中；光滑球擬酵母菌和近平滑假絲酵母菌均為粉紅色，但光滑球擬酵母菌菌落非常光滑，有折光性，而近平滑假絲酵母菌則很有質(zhì)感，成毛鍋樣；葡萄牙假絲酵母菌有藍紫色的肉和色；漢遜假絲酵母菌經(jīng)過培養(yǎng)后，除了藍紫色較柔和外也有凸起的乳頭狀；頭地霉的主要形態(tài)非常的圓，邊緣呈現(xiàn)毛刺狀，經(jīng)過多天培養(yǎng)后，整個菌落在培養(yǎng)基表面上凸起；克柔假絲酵母菌邊緣為白色、中心為粉紅色，菌落兩端沿線生長，易和頭地霉相混；釀酒假絲酵母呈紅紫色，乳頭狀明顯；粘紅假絲酵母的典型顏色為磚紅色；折皺假絲酵母及季也蒙假絲酵母不常見。

（三）生化鑒定

利用顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母真菌可以進一步利用儀器法或試條法進行鑒定。

法國生物 VPI 系統(tǒng)進行的酵母染真菌的儀器、試條法鑒定，是利用酵母陽真菌對糖的利用試驗。儀器法有許多的孔，每個孔都是銅化實驗，而 EPR20C 試條則是用 19 個銅化測定的干存體物小杯組成，共 20 個小杯，其中有生長對照杯，小杯內(nèi)含有半固體微量培養(yǎng)基供接種用，只有酵母染真菌才能生長。測定結(jié)果是以生長對照物的濁度比較，如果等于或大于生長孔的濁度則判定為陽性，鑒定結(jié)果是參照分析圖索引軟件其中的數(shù)據(jù)庫進行鑒定，方法較客觀， 20 ℃可鑒定多達 43 種酵母樣真菌。

（四）分子生物學(xué)檢測

質(zhì)譜檢測微生物的原理主要是通過激光、照射經(jīng)基質(zhì)消化的樣品，使樣品中的蛋白質(zhì)游離出來，在環(huán)形電極的典廠中進行加速運動，不同質(zhì)量的蛋白質(zhì)推行的距離不同，從而形成了獨有的蛋白質(zhì)圖譜，根據(jù)蛋白質(zhì)圖譜的形狀和分布進行菌種的鑒定。目前 VDI 的質(zhì)譜系統(tǒng)可以鑒定多達 50 種的真菌。

對于絲狀真菌的質(zhì)譜鑒定，應(yīng)當(dāng)采用純培養(yǎng)物進行鑒定。第一步是取適量的菌落，加入酒精進行萃取，靜置后棄去上清，對沉淀物加 70% 的酒精，再加入 40ul 的引精，離心后取沉淀，此時為已經(jīng)萃取好的菌種，可以涂板加甲酸進行鑒定。對于酵母樣真菌，可以直接將酵母樣真菌涂于靶板上，在未干燥之前加入 1ul 的甲酸后進行鑒定。質(zhì)譜的優(yōu)勢在于檢測的快速。

在分子生物學(xué)檢測中還有利用擴增反應(yīng)的一些鑒定方法，如 RAPD 隨機顏物 PCR ，選擇 18SrDNA 和 28SrDNA 相對保守的區(qū)域，設(shè)計真菌的引物，可以進行鑒定。

DNA 測試仍然是真菌鑒定最精標準，可以用于對于其他方法的比對實驗。分型方法也可以用于真菌的鑒定。

（五）血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷的 G 試驗和 GM 試驗對真菌感染進行輔助性診斷。

（ 1 ） G 實驗

G 實驗是測定 1-3- β -D- 葡聚糖含量。葡聚糖廣泛存在于真菌細胞壁中， 1-3- β -D- 葡聚糖占據(jù)真菌細胞壁的 50% 以上，是真菌細胞壁的特有成分，而 1-3- β -D- 葡聚糖可以激活 G 因子，激活的 G 因子再可以去激活凝固酶原，使其轉(zhuǎn)化成為活性的凝固酶，該酶切斷凝固蛋白原中特定位置的精氨肽鏈，使蛋白發(fā)生凝結(jié)，以此來測定反映出真菌細胞壁中 1-3- β -D- 葡聚糖的含量。

導(dǎo)致 G 實驗假陽性的因素可能有：污染；應(yīng)用纖維素膜進行血液透析患者；某些紗布或其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖；某些品牌的靜脈制劑（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；某些細菌敗血病患者（尤其是鏈球菌敗血癥）；抗腫瘤類藥物（香菇多糖、裂殖菌多糖）；磺胺類藥物；蘑菇類食物等。一切含有葡聚糖的物品都會影響到 G 實驗其形成假陽性，因此在得到陽性結(jié)果時，應(yīng)當(dāng)追蹤詢問一下臨床醫(yī)生是否有影響因素。

G 試驗結(jié)果：當(dāng)陰性值小于 60pg/ml 時可以排除侵襲性真菌感染，當(dāng)大于 100pg/ml 時則有異意。但因如果宿主不具備宿主感染因素以及侵襲性真菌感染的其他臨床癥狀，也不能輕易診斷，應(yīng)當(dāng)詢問臨床核實有無假陽性的影響因素在內(nèi)?；疑珔^(qū)間應(yīng)結(jié)合臨床動態(tài)觀察。危急值尚不明確，建議將 G 試驗兩次陽性結(jié)果作為危急值報告。

（ 2 ） GM 試驗

GM 試驗是用于輔助診斷曲霉菌感染的一個血清學(xué)實驗。

半乳甘露聚糖，簡寫為 GM ，是曲霉菌細胞壁上一種獨特的多聚抗原， GM 試驗就是檢測這一類多聚抗原的實驗。

實驗原理是直接競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢，敏感性可以達到 83% ，特異性可以達到 90% ，同時 GM 陰性可以排除曲霉病，應(yīng)用價值要高于陽性應(yīng)用價值。

當(dāng) GM 實驗結(jié)果大于 0.95 μ g/L 時，判為陽性，懷疑有曲霉菌感染。當(dāng)小于 0.75 μ g/L 時，則可以排除曲霉菌感染?；覅^(qū)范圍建議建議連續(xù)多次檢測并應(yīng)結(jié)合臨床資料綜合評價。

聲明：以上內(nèi)容來自網(wǎng)絡(luò)，若有侵權(quán)，請聯(lián)系我們，立即刪除！所有的觀點由網(wǎng)友個人想法，不代表本公司也持此立場，感謝大家支持！

重慶英沐教育科技有限公司

YMU教育

重慶YMU教育_醫(yī)學(xué)繼續(xù)教育學(xué)分卡

重慶YMU教育_小學(xué)初中高中教育課后輔導(dǎo)

重慶YMU教育_執(zhí)業(yè)醫(yī)師護士藥師資格考試考前輔導(dǎo)

www.kawsbarofficials.com